《植物业生物技术》课程实验教学大纲

　　 　　

　　课程编号：0130000042
　　一、 实验要求
　　要求员工通过本课程实验教学，加深理解和巩固所学理论知识，掌握一些生物技术基本实验技能，学会设计试验，正确使用常规仪器，正确记录，合理分析、讨论实验结果。同时加强对员工进行科学素质和良好的实验室工作习惯的训练。
　　二、实验教学条件
　　bevictor伟德分子生物学实验室已具备分子生物学试验的基本条件，可满足“细菌质粒提取”实验的顺利完成；bevictor伟德细胞工程实验室具备细胞培养的基本条件，可满足“植物转基因”综合设计实验的完成。
　　三、实验材料
　　植物：油菜、烟草等。
　　微生物：大肠杆菌和农杆菌。
　　四、实验课主要内容
 　　

序号	实验项目	学时	实验类别（基础实验、综合实验、设计实验等）	实验类型（上机、实验等）	实验内容	具体要求
1	细菌质粒提取	2	基础实验
2	农杆菌介导的植物遗传转化	8	综合设计实验		农杆菌培养； 植物外植体培养； 农杆菌转化植物； 转化体筛选	实验设计完整可行；能熟练掌握无菌操作技术。
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　　五、考核方式与评分办法
　　1． 实验设计方案  30％；
　　2． 试验操作和技能 40％；
　　3． 试验结果与分析  30％。
　　实验一  质粒DNA的提取
　　（基础实验）
　　实验目的
　　使员工了解细菌质粒提取的不同方法，掌握细菌培养的方法和大肠杆菌质粒微量提取的方法。
　　实验原理
　　碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
　　仪器、材料与试剂
　　仪器：恒温培养箱、恒温摇床、小型高速离心机、高压灭菌锅。
　　材料：带有质粒的大肠杆菌
　　试剂：
    Solution I
        50mmo1／L  葡萄糖
        5mmo1／L  三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)
        1.0 mmo1／L  乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
    Solution II
        0.4mo1／L Na0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合
    Solution III
        5mo1／L 醋酸钾  60  mL
        冰乙酸          11.5mL
        水              28.5mL
    TE缓冲液
        10mmo1／L Tris·HCl
         1mmo1／L EDTA(pH8.0)
    胰RNA酶(RNA酶A)
　　将RNA酶溶于10mmo1／L Tris·HCl(pH7.5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。
实验步骤 （采用SDS碱裂解法小量制备质粒DNA）
　　1．大肠杆菌培养
　　2．提取质粒
　　3．质粒的琼脂糖凝胶电泳
　　实验操作步骤
　　1．将过夜培养的2m1细菌，高速离心1分钟，彻底去除上清。
　　2．加入100ml solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
　　3．加入200ml Solution II，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。
　　4．加入400ml Solution III，立即上下颠倒5～10次，使之充分中和，室温放置2分钟。
    注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。
　　5．高速离心，15,000转／分钟，10分钟。无需低温离心。
    注意：提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。
　　6．取出2m1样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S柱里。盖上离心管盖子，室温放置2分钟 (室温放置时间不重要，可长可短)；用台式离心机室温高速(12，000转／分钟)离心1分钟。
　　注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。
　　离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部分溶液从柱子底部流出，为正常现象。
　　7．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700ml Wash Solution到3S柱，离心1分钟。
8．重复步骤7一次。
9．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同—支收集管中，高速离心2分钟。
10．将3S柱放入干净的1．5m1的离心管中，在3S柱子膜中央加 50ml TE或水，不要盖上离心管盖, 室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。
　　注意：将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。测序用质粒用30ml预热的水洗脱，浓度一般满足测序要求。
　　11．洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或-20℃保存备用。lml过夜培养细胞，质粒如果用50ml水洗脱，通常情况下可以取10ml洗脱液做Agarose电泳或酶切分析。

　　实验二 农杆菌介导的植物遗传转化
　　（综合设计实验）
　　（一）实验目的
　　1．使员工全面了解农杆菌介导的植物转基因的方法；
　　2．使员工根据已学的知识，在教师指导下设计一个农杆菌介导植物的遗传转化实验方案；
　　3．使员工掌握农杆菌培养，植物外植体无菌系建立，农杆菌侵染和转化体筛选等一系列试验方法。
　　（二）培养基
　　1．LB培养基：每升含有：酵母浸膏 5 g , 胰蛋白胨 10 g ，NaCl 5 g ，PH 7.2
　　2．YEB培养基：每升含有：牛肉浸膏 5 g ，酵母浸膏 1 g ,蛋白胨 5 g ，蔗糖 5 g ，MgSO4·H2O 0.5 g ，PH 7.0
　　　3．YEP培养基：每升含有：牛肉浸膏 10 g ，酵母提取液 10 g ，NaCl 5 g ，PH 7.0
　　4．实生苗培养基： 1/2MS培养基，附加30g蔗糖和0.6％琼脂，PH=6.0。
　　5．预培养基：MS+1.0～1.2mg/L  2，4-D+0.2mg/L 6-BA+30g蔗糖+6g琼脂，PH=5.8。
　　6．分化培养基：MS+0.2mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA+30g蔗糖+6.5g琼脂+AgNO36mg/L， PH=5.8。
　　7．筛选培养基：分化培养基+AgNO3 6mg/L+500mg/L Cb+10mg/L Kan，PH=5.8。
　　（三）试验仪器
　　超级超净工作台
　　智能气候培养箱
　　大型落地式高速冷冻离心机
　　凝胶成像系统
　　台式常温高速离心机
　　立式灭菌锅
     电泳相关设备
　　（四）农杆菌介导植物转化实验步骤（以油菜子叶转化为例）
　　1．根癌农杆菌的培养
　　将保存于甘油中的菌种用划线法接种于LB固体平板培养基上培养，每次转化前一天从平板上挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，在26℃，170r/min的摇床上过夜培养，当OD600值达0.3～0.5时，将其在4000r/min的条件下离心5min，弃去上清，然后用液体MS培养基将其重悬稀释5～8倍待用。
　　2．建立无菌苗
　　将油菜种子用75%酒精浸泡30s后，于0.1%HgCl2溶液中处理10min，无菌水冲洗3次后，接种于1/2MS固体培养基上，在25±1℃黑暗条件下培养3d，后移至光下培养1～3d，取其下胚轴和带柄子叶接种在预培养基上，在25℃，光照强度为2000lux，16h光照周期培养条件下培养，待用。
　　3．农杆菌侵染
　　在无菌条件下，将预培养2d子叶和下胚轴收集于一个无菌小烧杯中，浸入于活化并稀释了5～8倍的农杆菌液中，5min后转到无菌滤纸上，吸干多余的菌液，接至共培养培养基中，在25℃生化培养箱中共培养2 d。
　　4．分化培养 
　　将共培养2d的受体材料先用无菌水冲洗2～3次至水澄清后，用500mg/LCef浸泡30～40min，材料取出并置于含有无菌滤纸的培养皿中干燥2d。将培养物转移至附加8～15mg/L卡那霉素和500mg羧苄青霉素（或头孢霉素）的分化培养基中，在25℃，昼夜光周期为16／8h恒定光照条件下培养，
　　5．筛选培养
　　将分化培养中获得的绿芽移置筛选培养基（卡那霉素浓度升致25mg/L），每隔15～20d转接一次。
　　注：上述方法步骤供员工设计实验方案时参考。员工可自己设计烟草的遗传转化实验方案。